Первая картина.
Сырые и холодные подземелья Белоцерковского дворца. В одном из них сидит прикованный к стене цепями Кочубей. Подтвердилось худшее его предположение: Петр I не поверил доносу и отдал доносчика в руки Мазепы: «Заутра казнь…» Бессильное отчаяние овладевает Кочубеем. Мрачные размышления прерываются появлением прислужника Мазепы Орлика. От имени гетмана он требует признания о спрятанных Кочубеем кладах. Услышав решительный отказ выдать тайну, разъяренный Орлик приказывает вновь пытать узника.
Вторая картина.
Мазепа любуется красотой украинской ночи с балкона своего дворца. Но ни красота, ни мысли о Марии не могут смягчить в его душе. Вошедшему Орлику отдается приказ готовить казнь Кочубея.
К гетману неслышно подходит Мария. Беспокойством и ревнивыми подозрениями полно ее сердце. Успокаивая ее, Мазепа раскрывает Марии свою тайну: «…быть может, трон воздвигну я!» Мария с восторгом выслушивает это признание и в ответ на осторожный вопрос гетмана, кто ей дороже – он или отец, в ослеплении отвечает: «Ты мне всего, всего дороже!»
Однако оставшись одна, Мария вновь оказывается во власти тревожных предчувствий, неожиданно появляется проникшая сюда с риском для жизни мать, которая умоляет дочь спасти отца. С ужасом узнает о готовящейся расправе над Кочубеем и, увлекаемая матерью, спешит к месту казни.
Третья картина.
Толпы народа заполнили поле в окрестностях Белой Церкви: здесь должна свершиться казнь. Появляются палачи с топорами, проезжает на коне Мазепа, сопровождаемый возмущенными возгласами народа, распевает песенку пьяный казак. Стража гетмана и монахи ведут осужденных. В предсмертной молитве опускаются на колени Кочубей и Искра, а затем, обняв друг друга, всходят на эшафот. Прибежавшие на поле мать и Мария уже не могут остановить происходящее – казнь совершается.